cDNA文庫構(gòu)建是指某生物某發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。
一、SuperscriptII—RT合成第一鏈
1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中加入xulmRNA(大約500ng)、1ulXhoIPrimer(1.4ug/ul)、
(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-xulRNase-freewater）
說明：大于500ngmRNA分n管(500ng/tube)合成第一鏈，第一鏈合成完畢后將n管合成一管進(jìn)行第二鏈合成。
2.混勻后，70℃反應(yīng)10分鐘。
3.反應(yīng)完成后，立刻將反應(yīng)體系置于冰上5min。
4.稍微離心一下，順序加入以下試劑：
?。?）4ul5×firststrandbuffer
?。?）2ul0.1MDTT
?。?）1ul10mMdNTP(自己配制)
cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達(dá)的基因。但對(duì)真核細(xì)胞來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從cDNA文庫獲得的不同，基因組DNA文庫所含的是帶有內(nèi)含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA。
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